Avaliação in vitro de nanoemulsões espessadas com poloxâmero 407 como co-carreadoras de Crispr/Cas9 e dexametasona para edição gênica da mucopolissacaridose tipo I

Resumo

Introdução: A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença genética rara, caracterizada pela deficiência da enzima lisossômica alfaLiduronidase (IDUA), que resulta no acúmulo de sulfato de heparano e sulfato de dermatano em tecidos distintos. Há limitações clínicas nos tratamentos atuais, como o transplante de célulastronco hematopoiéticas, devido aos riscos associados e escassez de doadores compatíveis. A terapia gênica, por meio do sistema CRISPRCas9, tornase uma alternativa terapêutica promissora e inovadora no controle das manifestações articulares e neurológicas da doença. Objetivos:Avaliar a toxicidade in vitro e a transfecção de nanoemulsões espessadas com poloxâmero 407, utilizadas como sistema cocarreador de dexametasona, do plasmídeo CRISPRCas9 e do plasmídeo doador da sequência do gene IDUA, em sinoviócitos com características fibroblásticas (FLS) de camundongos modelo da MPS I. Métodos: A eficiência de complexação entre o plasmídeo e a nanoemulsão foi avaliada por meio de eletroforese; a internalização celular da formulação foi visualizada por microscopia óptica de fluorescência; avaliação da citotoxicidade pelo ensaio de MTT; potencial irritativo foi determinado pelo teste HETCAM; a atividade enzimática da IDUA avaliou a eficiência da transfecção. Resultados: A eletroforese indicou que a complexação dos plasmídeos às nanoemulsões foi eficiente, com impedimento da migração de ácidos nucleicos. A incubação de quatro horas, em comparação com a de duas horas, revelou maior número de complexos de internalização e a internalização da formulação foi melhor visualizada. Pelo ensaio de MTT, foi possível verificar que os FLS tratados com concentrações crescentes da formulação após 72h apresentaram uma elevada viabilidade, acima de 75%. O cultivo celular tratado com complexos de nanoemulsão/pCas9/pIDUA obteve maior atividade enzimática de IDUA (com poloxâmero 7,5% ± 2,5 e sem poloxâmero 5,6% ± 4,2) em comparação ao grupo os plasmídeos livres pIDUA ou pIDUA/pCas9, respectivamente 2,8% ± 0,6 e 4,0% ±1,2. O teste HETCAM indicou que os complexos sem poloxâmero 407 são nãoirritantes, a nanoemulsão espessada e sem dexametasona apresentou leve irritabilidade, enquanto a formulação espessada e cocarreadora do fármaco foi moderadamente irritante, resultando numa alta tolerabilidade e baixo potencial irritante. Conclusões: As formulações desenvolvidas mostraramse seguras e eficazes in vitro, apresentando baixo potencial citotóxico e irritativo, sendo sistemas promissores para aplicação in vivo na terapia gênica da MPS I.